植原體是一類無(wú)細(xì)胞壁的原核微生物，能侵染包括農(nóng)作物、林木、花卉、雜草等植物，給農(nóng)、林業(yè)帶來(lái)巨大損失，近年來(lái)，此類病害在某些重要植物處于蔓延和加重的趨勢(shì)。這類微生物尚不能在人工培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、與寄主植物的互作等方面也有其明顯不同特點(diǎn)，研究制定此類微生物的保藏技術(shù)規(guī)程，對(duì)于植原體菌種資源的規(guī)范和安全保藏、科學(xué)研究及合理利用具有重要意義
1、范圍本規(guī)程規(guī)定了植原體菌種保藏的基本原則、方法及技術(shù)要求。
本規(guī)程適用于各類植原體菌種的保藏。
2、術(shù)語(yǔ)與定義
1）植原體 phytoplasma
指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲(chóng)體內(nèi)的、具有三層單位膜結(jié)構(gòu)的無(wú)細(xì)胞壁的原核生物。一般引起植物葉片黃化和發(fā)育畸形等癥狀。
2）植物組織培養(yǎng) plant tissue culture
在無(wú)菌的條件下，將離體的植物器官和組織在人工控制的環(huán)境下培養(yǎng)，使其再生形成完整植株的過(guò)程。培養(yǎng)植原體—植物共生體即是培養(yǎng)已感染植原體病菌的植物外植體。
3、原理
植原體菌種尚不能在離體人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。被感染的寄主植物攜帶植原體，因而通過(guò)對(duì)植物莖段的繁殖，即可達(dá)到對(duì)所攜帶植原體的繁殖和培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)繁殖，使植原體所受的選擇壓力較低，較低的溫度條件可大大減緩植物和所感染植原體的代謝活動(dòng)，從而減少菌株突變，降低繁殖速度，有效保持菌種原有性狀。
4、技術(shù)要求
1）保藏方法
用組織培養(yǎng)法保藏感染植原體的植物組織，于5-25 C溫度范圍內(nèi)保藏。
2）植物組織培養(yǎng)基選用適于植物組織正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，不含四環(huán)素簇抗生素或其它對(duì)植原體生長(zhǎng)和繁殖有抑制作用的成分。
3）培養(yǎng)溫度和光照
培養(yǎng)溫度20-28 ℃為宜光照強(qiáng)度在1000-3000 lx，光期為10-14h/d
4）保藏溫度和時(shí)間
常溫保藏（20-28 ℃），保藏時(shí)間1-3個(gè)月,低溫保藏（6-10 ℃），保藏時(shí)間6個(gè)月至1年。
注：保藏溫度低于4 ℃會(huì)凍傷植物組織材料而導(dǎo)致植原體死亡。
5）保藏期檢測(cè)
定期檢查保藏菌種的房間、冷庫(kù)、冰箱的溫度、濕度。
檢查各保藏試管有無(wú)雜菌污染現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)雜菌污染，則取出該管重新移植，培養(yǎng)后補(bǔ)缺。
6）移植復(fù)核
大量植原體-植物共生體進(jìn)行移植時(shí)，各菌株的編號(hào)、所用培養(yǎng)基需仔細(xì)核對(duì)無(wú)誤。每次移植培養(yǎng)后，對(duì)照原保藏的菌株和菌種順序號(hào)卡片名錄，核實(shí)無(wú)誤再行存放。
7）保藏指標(biāo)
當(dāng)獲得的組培苗表現(xiàn)典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀察到特異植原體 DNA 熒光后即可進(jìn)行菌株的保藏。
5、操作方法與步驟
1）帶菌外植體采集
在田間采集表現(xiàn)典型癥狀的新鮮枝條，剪去葉和嫩稍，經(jīng)酒精和升汞等消毒劑表面消毒后，截成具節(jié)莖段，移入培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
2）無(wú)雜菌組培苗的獲得
外植體長(zhǎng)出新枝后，選無(wú)雜菌感染的外植體，截取新枝，移入新配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)和繁殖。如培養(yǎng)基被雜菌污染，將組培苗再進(jìn)行表面消毒處理，移入新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)操作2-3次，直至獲得無(wú)雜菌組培苗為止。
3）組織帶菌鑒定
用DAPI熒光顯微鏡技術(shù)和PCR技術(shù)鑒定組織帶菌狀況和濃度。
DAPI熒光顯微鏡技術(shù)步驟：取植物幼莖、葉柄或根等，進(jìn)行組織切片，厚度在100mm左右，用5％固定2小時(shí)左右，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）洗滌后，用1mg /ml 4'6－二瞇基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，zui后置于落射熒光顯微鏡下檢查韌皮部特異性植原體DNA熒光，激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為365nm,阻斷濾光片波長(zhǎng)為420nm。
PCR技術(shù)步驟：從組織中提取植物和植原體總DNA，用植原體16S rRNA等基因序列的引物進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶。
4）常溫保藏
植原體-植物共生體在適宜的組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并正常溫度和光照下（20-28 C，光照強(qiáng)度在1000-3000 lx）進(jìn)行保藏，保藏周期為1-3個(gè)月。
5）低溫保藏
將正常溫度和光照下（20-28 C，光照強(qiáng)度在1000-3000 lx）培養(yǎng)的植原體-植物共生體移入含組織培養(yǎng)基的試管內(nèi)，移入6-10 C低溫冷藏柜內(nèi)保藏，1-2個(gè)月將試管暴露于正常培養(yǎng)溫度和光照條件下補(bǔ)光2-3天，然后存放于低溫冷藏柜繼續(xù)保藏，保藏周期為6個(gè)月至1年以上。