一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

  1、了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、基本原理、維護(hù)和保養(yǎng)的方法。

  2、掌握普通光學(xué)顯微鏡的正確使用方法。

  1、鏡座：是移動(dòng)顯微鏡的把手，其作用是支撐整個(gè)顯微鏡。有的顯微鏡的鏡座內(nèi)還裝有反光鏡和光源組。

  2、鏡臂：是移動(dòng)顯微鏡的把手，它支撐和固定鏡筒、載物臺(tái)及調(diào)焦裝置。直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處有活動(dòng)關(guān)節(jié)，可按需要將鏡臂調(diào)節(jié)至適當(dāng)傾斜度。

  3、鏡筒：是顯微鏡上方的空心圓筒，其內(nèi)噴以無光黑漆(避免光線亂反射)，上端套接目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器連接。鏡筒有單筒和雙筒兩種。單筒可分為直立式和傾斜式兩種；雙筒都是傾斜式的。雙筒鏡筒有調(diào)距裝置，可調(diào)節(jié)兩鏡筒之間的寬度，其中的一個(gè)鏡筒上還裝有視度調(diào)節(jié)。鏡筒上緣到物鏡轉(zhuǎn)換器螺旋下端的距離稱為鏡筒長度或機(jī)械長度。調(diào)節(jié)式鏡筒附有刻度，一般可調(diào)范圍為155-250毫米；固定式的為160或170毫米。

  4、物鏡轉(zhuǎn)換器：連接于鏡筒的下端，其上有3-4個(gè)圓孔，可順序安裝不同倍數(shù)的物鏡，使用時(shí)跟據(jù)需要轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器來更換觀察用的物鏡。

  5、載物臺(tái)：亦稱工作臺(tái)，固定在鏡臂上，方形或圓形，有一通光孔，臺(tái)面上裝有推進(jìn)器和彈簧，可推動(dòng)和固定標(biāo)本。有的顯微鏡在載物臺(tái)兩邊或一邊(或在推進(jìn)器上面，或在載物臺(tái)下面)裝有兩個(gè)移動(dòng)手輪，轉(zhuǎn)動(dòng)移動(dòng)手輪可使載物臺(tái)前后左右移動(dòng)，便于觀察標(biāo)本的任一視野。有的顯微鏡在載物臺(tái)的縱向和橫向上裝有游標(biāo)尺，可測(cè)定標(biāo)本的大小，也可用來對(duì)被檢視野作標(biāo)記，以便下次觀察時(shí)再檢查該視野。ZXCI

  普通光學(xué)顯微鏡的標(biāo)本移動(dòng)器的橫向移動(dòng)范圍為60毫米，縱向移動(dòng)范圍為25毫米，游標(biāo)格值0.1毫米。

  6、調(diào)焦裝置：安裝在鏡臂的兩側(cè)，與鏡筒或載物臺(tái)連接。調(diào)焦裝置包括粗動(dòng)調(diào)焦手輪和微動(dòng)調(diào)焦手輪，轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦手輪可使鏡筒或載物臺(tái)上下移動(dòng)，以調(diào)節(jié)焦距，使標(biāo)本與物鏡的距離等于物鏡的工作距離。ZXCI

  普通光學(xué)顯微鏡的粗微動(dòng)調(diào)焦范圍為15毫米，微動(dòng)調(diào)焦格值為0.002毫米。

  1.目鏡；2.鏡筒；3.鏡臂；4.玻片；5.游標(biāo)卡尺；6.粗準(zhǔn)焦螺旋；7.細(xì)準(zhǔn)焦螺旋；

  8.底座；9.光源；10.虹彩光圈；11.聚光器；12.載物臺(tái)；13.物鏡；14.轉(zhuǎn)換器

  1、目鏡：也稱接目鏡，安裝在鏡筒的上端。目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)像進(jìn)一步擴(kuò)大。目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的叫接目透鏡，下面的叫會(huì)聚透鏡。上下透鏡之間裝有一個(gè)光闌。光闌的大小決定視野的大小。目鏡的光闌上還可以放置測(cè)微目尺。顯微鏡通常配備有10倍、16倍等幾種目鏡。

  2、物鏡：也稱接物鏡，安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，物鏡的作用是把標(biāo)本作次放大。??據(jù)需要時(shí)的條件不同，可以把物鏡分為干燥物鏡(包括低倍物鏡和高倍物鏡)和油浸物鏡。干燥物鏡在使用時(shí)，標(biāo)本片與物鏡之間的介質(zhì)是空氣。干燥物鏡按放大倍數(shù)還可以分為低倍物鏡、中倍物鏡和高倍物鏡。一般把10倍以下的物鏡叫低倍物鏡，把20倍的物鏡叫中倍物鏡，40-45倍或60倍的物鏡叫高倍物鏡。這些物鏡上標(biāo)有5×、10×、20×、40×、45×、60×。油浸物鏡是物鏡中放大倍數(shù)的鏡頭(90×或100×)，使用油鏡時(shí)，在標(biāo)本上加一滴鏡油作為介質(zhì)。國產(chǎn)顯微鏡的油鏡常標(biāo)有“油”字，國外產(chǎn)品則常用“oil”(oilImmersion)或“HI”(HemcyeneousImmersion)字樣，以供識(shí)別。物鏡上通常標(biāo)有放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑

  (亦稱鏡口率)、工作距離等主要參數(shù)。

  3、聚光器：也叫集光器，由聚光鏡和可變光闌組成。聚光鏡由一片或數(shù)片透鏡組成，其作用相當(dāng)于凸透鏡，起聚光的作用，以增強(qiáng)射入物鏡的光線?？勺児怅@也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾片金屬薄片組成，中心部呈圓孔。推動(dòng)可變光闌的把手可以任意調(diào)節(jié)孔徑的大小，其作用是通過調(diào)節(jié)光強(qiáng)度，使聚光鏡的數(shù)值孔徑和物鏡的數(shù)值孔徑相一致?？勺児怅@開得越大，則數(shù)值孔徑越大；反之，則數(shù)值孔徑越小。

  4、反光鏡：一般裝在聚光器下方的鏡座上，可以在水平和直方向任意旋轉(zhuǎn)。它的一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，其作用是使光源發(fā)出的光或自然光射向聚光鏡。光強(qiáng)時(shí)用平面鏡，光弱時(shí)用凹面鏡。有的顯微鏡的人工光源安裝在鏡座內(nèi)，其反光鏡也固定在鏡座內(nèi)。

  由單透鏡構(gòu)成的放大鏡和由透鏡組成的實(shí)體顯微鏡(解剖鏡)稱單式顯微鏡生物學(xué)教學(xué)及科研所用的光學(xué)顯微鏡一般是復(fù)式顯微鏡。

  由外界入射的光線經(jīng)反光鏡反射向上，或由內(nèi)光源發(fā)射的光線經(jīng)集光鏡向上，再經(jīng)聚光鏡會(huì)聚在被檢標(biāo)本上，使標(biāo)本得到足夠的照明，由標(biāo)本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進(jìn)入使光軸與水平面傾斜45

  度角的棱鏡，在目鏡的焦平面上，即在目鏡的視場(chǎng)光闌處，成放大的側(cè)光實(shí)像，該實(shí)像再經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像，所以人們看到的是虛像(圖1-l-2)。

  被檢物體經(jīng)顯微鏡的物鏡和目鏡放大后的總放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。如用放大40倍的物鏡和放大10倍的目鏡的總放大倍數(shù)是400倍。

  3．分辨率

  物鏡前面發(fā)光點(diǎn)發(fā)射的光線進(jìn)入物鏡的角度稱開口角度。透鏡的放大率與開口角度成正比，與焦距成反比。數(shù)值口徑(又稱開口率numericalaperture

  簡(jiǎn)寫為NA)是光線投射到物鏡上的開口角度一半的正弦，乘上標(biāo)本與物鏡間介質(zhì)的折射率的乘積。

  NA＝n×Sinθ

  NA為數(shù)值口徑；n是介質(zhì)折射率；θ為開口角度的半數(shù)。

  由于介質(zhì)為空氣時(shí)n＝1，值只能到90度(實(shí)際上不可能達(dá)到90

  度)，Sin90＝1，所以干燥系下物鏡的數(shù)值口徑都小于l。使用油鏡時(shí)，物鏡與標(biāo)本間的介質(zhì)為香柏油(n＝1.515)或液體石蠟(n=1.52)，不僅能增加照明度，更重要的是增大數(shù)值口徑，目前技術(shù)下的數(shù)值口徑為1.4。

  評(píng)價(jià)一臺(tái)顯微鏡的質(zhì)量優(yōu)劣，不僅要看其放大倍數(shù)，更重要的是看其分辨率。分辨率是指顯微鏡能夠辨別發(fā)光的兩個(gè)點(diǎn)或兩??細(xì)線間最小距離的能力。該最小的距離稱為鑒別限度(R)：

  R＝λ／2nSinθ＝λ／2NA

  R為鑒別限度；λ為光的波長。

  日光的波長λ＝0.5607μm≈0.6μm，如果用NA＝1.4的物鏡，則

  R＝0.6／2×1.4＝0.22μm

  4．工作距離

  工作距離是指觀察標(biāo)本最清晰時(shí)，物鏡透鏡的下表面與標(biāo)本之間(無蓋玻片時(shí))或與蓋玻片之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)越大，其工作距離越短，油鏡的工作距離最短、約為0.2mm，所以使用油鏡時(shí)，要求蓋玻片的厚度為0.17mm。雖然不同放大倍數(shù)的物鏡工作距離不同，但生產(chǎn)廠家已進(jìn)行校正，使不同放大倍數(shù)物鏡轉(zhuǎn)換時(shí)，都能觀察到標(biāo)本，只需進(jìn)行細(xì)調(diào)焦便可使物象清晰。

  E×O＝1000×NA

  據(jù)上式可知，在與物鏡的組合中，目鏡有效的放大倍數(shù)是有限的，過大的目鏡放大倍數(shù)并不能提高顯微鏡的分辨率。如用90×，NA為1.4

  的物鏡，目鏡有效的倍數(shù)是15×。

  相差顯微鏡與普通顯微鏡基本相同，只是在普通顯微鏡上附加光闌和相板等相差濾光裝1、環(huán)狀光闌：是由環(huán)狀圓孔構(gòu)成的光闌，大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤，安裝于聚光鏡下面。更換放大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換與其適應(yīng)的光闌。

  2、相板：裝于物鏡的后焦平面，有推遲直射光和衍射光相位，以及吸收光線收變亮度的作用。帶有相板的物鏡，稱為相差物鏡。

  3、合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡：為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸在一直線上，必須拔出目鏡，裝上特制的低倍望遠(yuǎn)鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)合軸。

  其使用方法是在普通光學(xué)顯微鏡上換上相差聚光器和相差物鏡，將用水封載的玻片標(biāo)本放在載物臺(tái)上，轉(zhuǎn)動(dòng)相聚光器，使與物鏡的開口率或放大倍數(shù)相一致，鏡檢見物像。取下目鏡，換上合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡，伸縮望遠(yuǎn)鏡筒，使看清物鏡相板上暗環(huán)和環(huán)狀光闌上的亮環(huán)；移動(dòng)彩虹光圈，使暗環(huán)和亮環(huán)圓心重合；升降聚光器，使兩環(huán)重合，即在亮環(huán)內(nèi)外側(cè)看到暗的邊緣。取下望遠(yuǎn)鏡，換上補(bǔ)償目鏡進(jìn)行鏡檢。鏡檢時(shí)只能以微動(dòng)螺旋調(diào)焦而不能轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器，否則需重新進(jìn)行合軸調(diào)整。更換物鏡時(shí)也要重新進(jìn)行合軸調(diào)整，然后才能觀察。相差顯微術(shù)需用水作封載劑并加蓋玻片。載玻片和蓋玻片厚度分別為1.0-1.2、0.17-0.18毫米，清潔無損。

  (一)儀器和其他物品

  顯微鏡的使用方法。

  (二)光源

  顯微鏡不能采用直射陽光。晴天可用近窗的散射光作光源。也可用日光燈作為光源。而專為顯微鏡照明而制造的聚絲電燈是較好的光源。

  在接通電源后，取下目鏡，直接向鏡筒內(nèi)觀察，并調(diào)節(jié)聚光鏡上的孔徑光闌，使其孔徑與視野恰好一樣大或略小于視野，其目的是使入射光展開的角度與物鏡的數(shù)值口徑(開口率NA)相一致，既可充分發(fā)揮該物鏡的分辨力，又能把超過該物鏡可能接受的多余光擋住，否則能產(chǎn)生干擾．影響清晰度。所以，原則上使用不同的物鏡時(shí)應(yīng)相應(yīng)調(diào)節(jié)孔徑光闌。放回目鏡后，通過調(diào)節(jié)聚光器上的視??光闌或調(diào)節(jié)照明度控制鈕，選擇的照明效果。

  1．標(biāo)本放置

  2．調(diào)焦

  轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，升高鏡臺(tái)(或下降鏡筒)、使低倍物鏡的前端接近載片，用左眼在目鏡上觀察，并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)下降(或鏡筒上升)，可看到物像，然后轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，使物假清晰。

  3．換高倍鏡

  用低倍鏡看到物像后，轉(zhuǎn)動(dòng)標(biāo)本移動(dòng)器上的螺旋，選擇合適的視野，并把要觀察的部位置于視野的，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器把高倍鏡置鏡筒下方。顯微鏡在設(shè)計(jì)制造時(shí)，都是共焦點(diǎn)的，即低倍鏡對(duì)焦后，轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)一般都能對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)，能看到物像，只需轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋便可使物像清晰。通過調(diào)節(jié)集光鏡上的視??光闌或照明度控制鈕使獲得照明。

  由于細(xì)菌個(gè)體微小，需要用油鏡進(jìn)行觀察。

  1．滴加鏡油

  轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)下降(或使鏡筒上升)在染色標(biāo)本處滴加1－2滴液體石蠟或香柏油。

  2．轉(zhuǎn)換油鏡

  轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，把油鏡置鏡筒下方。

  3．調(diào)焦

  轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)上升(或鏡筒下降)，讓鏡頭的前端浸入鏡油中。操作時(shí)要從側(cè)面仔細(xì)觀察，只能讓鏡頭浸入鏡油中緊貼著標(biāo)本而避免讓鏡頭撞擊載玻片，導(dǎo)致玻片和鏡頭損傷。然后在目鏡下進(jìn)行觀察，并緩慢??轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使鏡臺(tái)下降(或使鏡筒上升)即可看到清晰的物像。

  轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使鏡臺(tái)下降(或使鏡筒上升)時(shí)，若油鏡已離開油滴，必須重新進(jìn)行上述調(diào)節(jié)操作。不得邊用左眼在目鏡上觀察，邊轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使鏡臺(tái)上升(或鏡筒下降)使鏡頭前端浸入油滴中，這樣易使鏡頭撞擊載玻片，損標(biāo)本和鏡頭。

  4．調(diào)節(jié)孔徑光闌和視光闌

  把孔徑光闌開到，使與油鏡的數(shù)值口徑相匹配，通過調(diào)節(jié)視覺光闌和照明度控制鈕選擇合適的照明。

  轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)下降(或使鏡筒上升)，取出染色標(biāo)本玻片，然后先用擦鏡紙接去油鏡上的香柏油，再用擦鏡紙沾少量二甲苯(不能用酒精)擦去沾在油鏡上的鏡油，最后用擦鏡紙擦凈二甲苯及鏡油。用液體石蠟作鏡油時(shí)，可以只用擦鏡紙即可擦凈，不(或僅用極少量)二甲苯。把鏡頭轉(zhuǎn)成“八”字形，套上鏡罩后放入顯微鏡柜中。

  顯微鏡是貴重精密的光學(xué)儀器，正確的使用、維護(hù)與保養(yǎng)，不但觀察物體清晰還可延長顯微鏡的使用壽命。

  Ⅰ防潮：顯微鏡應(yīng)放置在通風(fēng)干燥，灰塵少，不受陽光直接曝曬的方法。不使用時(shí)有機(jī)玻璃或塑料布防塵罩罩起來。也可套上布罩后放入顯微鏡箱內(nèi)或顯微鏡柜內(nèi)。還在鏡箱內(nèi)放一袋干燥劑(的是變色硅膠，干燥的硅膠呈藍(lán)色，吸潮后變?yōu)榈t色，淡紅色硅膠烘干呈藍(lán)色后，可繼續(xù)使用)。

  Ⅱ防塵：顯微鏡觀察室內(nèi)應(yīng)保持清潔，盡量避免進(jìn)塵。目鏡和物鏡如有塵污應(yīng)用擦鏡紙擦凈。用塑料袋罩上并放入鏡箱。

  Ⅲ防腐蝕：顯微鏡不要與揮發(fā)性藥品及酸、堿類藥品接觸，以免受腐蝕。

  Ⅳ防熱：顯微鏡不要放在日光曝曬，也不要放在靠近火爐、電爐或暖氣片的地方。

  Ⅱ防震：從顯微鏡箱或柜內(nèi)取出或放入顯微鏡時(shí)，應(yīng)一手提鏡劈，另一手托鏡座，讓顯微鏡直立，防止目鏡從鏡筒中脫落。

  Ⅵ保持清潔：顯微鏡的目鏡、物鏡、聚光鏡和反光鏡等光學(xué)部件必須保持清潔，防止長霉。鏡檢時(shí)通過轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡、物鏡及調(diào)整焦距等措施判斷灰塵或污臟所在的部位，如附有灰塵，則先用洗耳球去灰塵，或用擦鏡紙輕輕擦去。若有污臟，用擦鏡紙或脫脂棉球沾無水7份和無水乙醇3份的混合液輕輕擦拭。然后用擦鏡紙擦干。顯微鏡的金屬油漆部件和塑料部件，可用軟布沾中性洗滌劑進(jìn)行擦拭，不要使用有機(jī)溶劑。