小麥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix (2mM)             

4 μl     引物1(10pM)                 

2 μl     引物2(10pM)                 

2 μl     Taq酶 (2U/μl)               

1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保溫7min。

3結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

PCR實(shí)驗(yàn)步驟

典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán),通過多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是:

將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;

人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合,兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短;

耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸,合成DNA的

CSC, 小鼠心肌細(xì)胞

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）

MEF, 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

MM, 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞

mCF, 小鼠心臟成纖維細(xì)胞

MN-c, 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元

 細(xì)胞名稱

人絨毛膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞

人羊膜上皮細(xì)胞

人絨毛間充質(zhì)成纖維細(xì)胞

人羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞

人絨毛膜間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞

 正常細(xì)胞

NRK-52E，大鼠腎細(xì)胞

H9c2大鼠心肌細(xì)胞（ATCC來源）

C2C12, 小鼠肌原細(xì)胞

NIH/3T3, 小鼠成纖維細(xì)胞系

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星狀細(xì)胞系

CHO, 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系

COS-7L, 非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞

SF9, 昆蟲卵巢細(xì)胞

BRL 3A, 大鼠肝正常細(xì)胞

HK-2, 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞

HET-1A, 人食管上皮細(xì)胞

RGC-5, 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

GC-1, 鼠精原細(xì)胞

293A，人胚腎上皮細(xì)胞系（腺病毒包裝級(jí)別）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干細(xì)胞

293T, SV40轉(zhuǎn)化的人胚腎上皮細(xì)胞系