斑點氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用步驟

2020年05月21日 13:28:49人氣：788來源：上海研生生化試劑有限公司

　　斑點氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用步驟：

　　一、樣品 DNA 的制備

　　1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

　　2. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：

　　3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液(足夠 10 個樣品)為例：在一干凈塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但*在一周內(nèi)用完，不要長期放置。一次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。

　　4. 在標記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品(半粒芝麻大小)或 5uL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。

　　5. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

　　6. 95℃保溫 10 分鐘。

　　7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。

　　二、弓形桿菌屬通用PCR試劑盒設(shè)置 PCR 反應(yīng)(40 uL 體系)

　　8. 在 N+2 個 PCR 管中加入下列成分，下面以樣品數(shù)為 1 舉例(注意：如果*次使用DNA 釋放劑，*每個樣品設(shè)置兩個模板用量的 PCR 反應(yīng)，兩個反應(yīng)的模板使用量差 10 倍，由此確定*用量，以后就用效果*的那個模板用量)：

9. 輕柔混勻后上機，按下面參數(shù)進行 PCR。

　　10. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 216bp。陽性對照必須有此條帶出

　　現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴增，否則實驗無效。對沒有擴增產(chǎn)物的樣品，需要用通用引物(如真核生物專一 PCR 引物，需自備)測試是否有抑制劑或樣品是否濃度達到 PCR 的要求，如果通用引物也擴不出來，需要濃縮并再次純化 DNA 樣品，或者更換 DNA 提取方法，直到通用引物能夠擴增出預(yù)計大小的片段。

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斑點氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用步驟

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