弓形桿菌屬通用PCR檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)使用方法：

一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

2. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：

3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個(gè)樣品）為例：在一干凈塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但*在一周內(nèi)用完，不要長期放置。一次檢測一個(gè)樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個(gè)樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。

4. 在標(biāo)記好的 N+2 個(gè)離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大?。┗?5uL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。

5. 在每個(gè)管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

6. 95℃保溫 10 分鐘。

7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個(gè)樣品得到的 DNA釋放液足夠進(jìn)行 50-100 次 PCR。

二、弓形桿菌屬通用PCR試劑盒 設(shè)置 PCR 反應(yīng)（40 uL 體系）  

8. 在 N+2 個(gè) PCR 管中加入下列成分，下面以樣品數(shù)為 1 舉例（注意：如果*次使用DNA 釋放劑，*每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)模板用量的 PCR 反應(yīng)，兩個(gè)反應(yīng)的模板使用量差 10 倍，由此確定*用量，以后就用效果*的那個(gè)模板用量）：

成份

樣品（用量1）

樣品（用量2）

陽性對照

陰性對照

即用型 PCR Mix 3.0

20 uL

20 uL

20 uL

20 uL

源性 PCR 引物混合液

2 uL

2 uL

2 uL

2 uL

制備的樣品

18 uL

2 uL

無

無

樣品制備陽性對照

不加

不加

2 uL

不加

樣品制備陰性對照

不加

不加

不加

2 uL

超純水

不加

16 uL

16 uL

16 uL

9. 輕柔混勻后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR。

過程

溫度

時(shí)間

預(yù)變性

94℃

10分鐘

PCR 反應(yīng)

（35 個(gè)循環(huán)）

94℃

30s

60℃

30s

72℃

30s

延伸

72℃

7分

10. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 216bp。陽性對照必須有此條帶出

現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無效。對沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，需要用通用引物（如真核生物專一 PCR 引物，需自備）測試是否有抑制劑或樣品是否濃度達(dá)到 PCR 的要求，如果通用引物也擴(kuò)不出來，需要濃縮并再次純化 DNA 樣品，或者更換 DNA 提取方法，直到通用引物能夠擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的片段。