通過快速敏感的液相色譜-質(zhì)譜法串聯(lián)測定大鼠血漿中的人參皂甙Rb1，Rb2 和Rb3：在藥代動力學研究中的應(yīng)用

摘要

為了確定分別口服給藥（

50

毫克

/

千克）和靜脈給藥（

10

毫克

/

公斤）的

RB1

，

RB2

，和

R b3

后的大鼠體內(nèi)人參皂苷

RB1

，

RB2

，

和

R b3

的藥代動力學，

開發(fā)了一種靈敏快速液相色譜

- 

串聯(lián)質(zhì)譜法。血漿樣品用皂苷

Rg2

為內(nèi)標的飽和的正丁醇進行萃取。色譜分離，

Zorbax 

SB-C18

柱

（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

；

流動相，

甲醇

-1 mM

甲酸銨

（

74:26 

，

V / V

）

。

使用

RB1

，

RB2

和

RB3

分別為

M / Z 1107.7

→

M / Z = 178.9 

，

M / Z 1077.7 

→

M / Z 148.6 

，

與

m/z1077.7 

→

M / Z 783.4

的碎片轉(zhuǎn)換進行多反應(yīng)監(jiān)測模式。校正曲線在

20-1000

納克

/

毫

升的

RB1

和

R B2 

，

和

50-2500

納克

/

毫升為

Rb3

的濃度范圍回收。

檢出限分別為

3.0 ng / ml

和

4.0

納克

/

毫升和

6.5

納克

/

毫升。

3

種人參皂甙的日內(nèi)及日間變異均小于

15 

％

，準確度

在

86-114 

％。所有

3

種人參皂苷具有差的口服生物利用度（

RB1

，

RB2

，和

R b3

分別為

0.78

％

，

0.08

％

，

和

0.52

％）

。

皂苷

Rb1

的值比甙

Rb2 

或

Rb3

的更高，

表明通過口服給藥，

帶有己糖和羥基的人參皂甙（

RB1

）可以比那些在相同的糖基化位點帶有戊糖基團的呈現(xiàn)

更好的藥代動力學行為。

1.

說明

人參皂甙已被視為三七藥材的藥理作用的主要活性成分

[1]

。三七提取物中，人參皂甙

Rb1

是主要皂甙，甙

Rb2

和

Rb3

是其他小的成分。這三種人參皂甙均為

20

（

S

）

- 

原人參

二醇皂苷（

PPD

）

，并具有相同的糖基化位點（

C-3

位點，

C-20

位點）

。區(qū)別僅在于連接到

C-20

位點的糖苷。皂苷

Rb1

連接有兩個葡萄糖，

RB2

連接有一個葡萄糖和一個

α

-L-

吡喃阿

拉伯糖基，和

R b3

連接有一個葡萄糖和一個

β

-D-

木糖（圖

1

）

。

到現(xiàn)在為止，

人參皂苷的藥代動力學特性已經(jīng)出版了許多文獻。

劉等人。

發(fā)現(xiàn)，

RB1

，

RB2

，

Rc

和

Rd

靜脈給藥后均迅速在大鼠腦，肌肉和神經(jīng)組織分布

[2]

。

Song

等。報道

R1

，人參

皂苷

Rg1

和

Rb1

經(jīng)犬口服后的藥代動力學研究。結(jié)果表明，皂苷

Rb1

的

Cmax

為

28.6

納克

/

毫升

[3]

。

Chen

等人，報道稱，

皂甙

Rb1

的

T1 / 2

比

Rg1

和

R1

的更長

[4]

。

皂苷

Rb1

的生物

利用度一直

報道為

4.35

％

[5]

。在

Ra3

，皂苷

Rb1

，

Rd

，

Re

，皂苷

Rg1, R1

的吸收和分布的

研究中，表明，大多數(shù)人參皂甙是受到廣泛迅速膽汁排泄，導致他們的短

T1 /2

值

[6]

。

雖然皂苷

Rb1

的藥代動力學特性已知，

RB2

和

Rb3

的信息是罕見的。實際上，關(guān)于甙

Rb2

和

Rb3

的藥代動力學行為的有限的信息已經(jīng)發(fā)布。因此，

RB2

和

Rb3

的藥代動力學的研究

是必要的，

有助于澄清藥代動力學和人參皂甙結(jié)構(gòu)偏好之間的關(guān)系。

由于人參皂甙在吸

收

203 nm

處有較差的紫外輻射

[5]

。

的液相色譜

- 

質(zhì)譜

（

LC-MS

）

[7-9]

和液相色譜

- 

串聯(lián)

質(zhì)譜（

LC-MS/MS

）

[10-12]

的方法被廣泛用于分析人參皂甙。

在這項研究中，我們開發(fā)了一個簡單，快速，靈敏的

LC-MS/MS

方法來確定口服和靜脈三

個人參皂苷給藥后，

RB1

，

RB2

，和

R b3

的血漿濃度，并進行系統(tǒng)的比較三種人參皂甙藥

代動力學行為的相似性和差異。

2.

材料和方法

2.1

化學藥品及試劑

人參皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，和

Rg2

，

（內(nèi)標，

IS

）

（

99%

）是從化學學院，吉林大學（長春，

中國）

。從安捷倫科技得到了甲酸銨。其他試劑是

HPLC

級。

2.2

儀器和分析條件

將

Agilent 1200

快速分離

HPLC

系統(tǒng)與配有電噴霧電離

（

ESI

）

的安捷倫

6410

三重四極桿質(zhì)

譜儀串聯(lián)。該柱是

Agilent ZORBAX SB-C 18

柱（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

。流動相：甲

醇和

1 mM

甲酸銨（

74:26

，體積

/

體積，

pH

值

6.0

）

，流速為

0.4

毫升

/

分鐘。對

RB1

，

RB2

，

RB3

和

IS

分別

M 

/ 

Z1107.7

→

M 

/ 

Z 

=178.9

，

M 

/ 

Z1077.7

→

M 

/ 

Z 

=148.6

，

M 

/ 

Z1077.7

→

m/z783.4

，和

m / z783.6

→

M / Z475.1

的負多反應(yīng)監(jiān)測來進行定量。

RB1

，

RB2

，和

R b3

的

裂解

/

碰撞能量的值分別在

250 V/55 V

，

210 V/67 V

，

200 V/58 V

。

流速，

9

升

/

分鐘

;

霧化壓力，

40

磅；氣體溫度，

350?C

。

2.3

校準曲線和血漿樣品的制備

標準曲線的制備用原液對空白大鼠血漿加標至濃度：

Rb1

和

Rb2

為

20

，

50

，

100

，

500,1000

納克

/

毫升，

RB3

為

50

，

100

，

500

，

1000

，和

2500

納克

/

毫升復(fù)用。樣品（

100

微升）與

IS

溶液（

1

微克

/

毫升，

10

微升）混合，用

900

微升飽和的正丁醇萃取。以

13,000

×

g

的離心

10

分鐘后，將上清液在氮氣流中蒸發(fā)濃縮至干。將殘余物溶解在

100

微升流動相中，并離

心

10

分鐘。取

20

微升的上清液注入到

LC-MS/MS

。

2.4

方法學驗證

基體效應(yīng)是通過濃縮到標準溶液的當量濃度后的物標的響應(yīng)的比較來評估。

QC

樣品制備為

三種濃度：

Rb1

、

Rb2

為

50

，

100

，和

1000ng/

毫升；

Rb3

為

100

，

500

，

2500ng/

毫升。在大

鼠血漿中的

QC

樣品（

N 

= 

5

）日內(nèi)和日間的檢測在三個獨立的天評估。通過將在相同的濃

度的

QC

（

n = 5

）樣品中的分析物，與后提取的空白大鼠血漿中被加標后的分析物的響應(yīng)的

比較，確定了萃取回收率。

QC

樣品（

N = 3

）被測定，在長凳上室溫下放

8

小時，做凍融–

處理重復(fù)三次，處理后樣品的穩(wěn)定性。

2.5

在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

SD

大鼠（

200

–

220 

g

）由廣東省實驗動物中心提供（廣州，中國）

。所有的研究是由南方醫(yī)

科大學倫理委員會批準。大鼠隨機分為六組：三組分別經(jīng)尾靜脈靜脈注射（

10

毫克

/

公斤）

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，另外三組分別口服人參皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

（

50

毫克

/

公斤）

。血液樣品

在

0.083

，

0.25

，

0.5

，

1

，

2

，

4

，

6

，

8

，

12

，

24

和

36 h

收集（

IV

）

，和

0.25

，

0.5

，

0.75

，

1

，

1.5

，

2

，

3

，

4

，

6

，

8

，

10

，

12

，

24

，

和

36 h

（

PO

）

。

血液樣品應(yīng)立即離心，

直到分析前在

−20?C

存儲。

3.

結(jié)果和討論

3.1

方法學驗證

在

Rb1

、

Rb2 20

–

1000ng/

毫升和

Rb 350

–

2500ng/

毫升的濃度范圍內(nèi)校準曲線為線性。檢測

限（

LOD

）為

3ng/

毫升，

4ng/

毫升，和

6.5ng/

毫升

基體效應(yīng)的結(jié)果是在

90

–

112%

（

n 

= 

5

）范圍。日內(nèi)和日間的準確度在

86

–

114%

，精密度

均在可接受的范圍內(nèi)，在三種濃度（

n = 5

）下。提取回收率在

52

–

117%

。在穩(wěn)定性評估時

所有樣品顯示小于

15%

（

RSD

）的變異。

3.2

藥代動力學研究中的應(yīng)用

該方法已成功地應(yīng)用于

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

在大鼠的藥代動力學研究。藥代動力學參數(shù)（表

1

）

采用

DAS2.0

軟件的非房室模型計算。

血漿濃度隨時間的分布如表

2

所示。

Tmax

結(jié)果表明，

Rb3

吸收zui快，

Rb1

是zui慢的。靜脈注射后的

T1 / 2

表明，三種人參皂甙在體內(nèi)消除緩慢。

相比之下，

Rb1

的消除是zui快的，而

Rb3

zui慢?？诜o藥后

Rb1

的

AUC0

–

36 

h

值，大約

比

Rb2

大

10

倍，比

Rb3

大近兩倍，這表明在大鼠

Rb1

的吸收比

Rb2

、

Rb3

高得多。生物利

用度為，

Rb1 0.78%

，

Rb2

的

0.08%

，和

Rb3 0.52%

，所有三種人參皂苷，口服吸收差。由于

系統(tǒng)地比較了三種人參皂苷藥代動力學特征，

我們推測人參皂苷的藥代動力學行為有結(jié)構(gòu)偏

好性。特別是，帶己糖和羥基的人參皂甙（

RB1

）比那些在相同的糖基化位點帶有戊糖基團

的可以更好的口服吸收。

4.

結(jié)論

一種簡單，

快速，

敏感的

LC

–

MS / MS

方法被開發(fā)為了大鼠血漿中人參皂苷含量的測定，

。

該法已成功應(yīng)用于在大鼠的

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

的藥代動力學研究。三種人參皂甙具有較差的

生物利用度。人參皂苷藥代動力學行為的結(jié)構(gòu)偏好。