一、免疫熒光技術(shù)中標(biāo)本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點(diǎn)如下：

1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。

2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

4、免疫熒光在封片時(shí)常使用封片劑或甘油：0.01M PBS （1：1）。條件許可，建議購買抗淬滅的封片液，使標(biāo)本可以保存更久。

5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。

6、熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多，需要分別設(shè)定陽性和陰性對照。

二、注意事項(xiàng)

1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長，可能會(huì)使熒光提前衰退。

2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對照：

（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物；

（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物；

（3） 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物。

三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談

1、選取一抗時(shí)，要求來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于家兔和大鼠的抗體，二抗則是不同熒光信號標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

2、我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要自我摸索，我感覺一抗4℃孵育過夜比較好，背景比較清晰。

3、我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記物。

4、封閉血清是二抗來源動(dòng)物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。

5、其余事項(xiàng)同免疫熒光單標(biāo)操作。