補(bǔ)體法

1．材料

（1）免疫血清 60℃ 滅活 20 min，用 Kolmers 鹽水作 2 倍稀釋成 1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用 1：10 稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為 1：32 則免疫血清應(yīng)作 1：8 稀釋。

（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作 1：10 稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果，按 2 單位的比例，用 Kolmers 鹽水稀釋備用。Kolmers 鹽水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸緩沖鹽水中，溶解 MgSO4 的含量為 0.01% 濃度。

（3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為 1：4，補(bǔ)體為 2 單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià) 1：4 的濃度用 Kolmers 鹽水稀釋備用。

2．方法步驟

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃ 作用 30 min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。

（3）用緩沖鹽水洗 2 次，攪拌，每次 5 min，吸干標(biāo)本周圍水液。

（4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體 30 min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸餾水洗 1 min，緩沖甘油封固。

3．對照染色

（1）抗原對照。

（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）滅活補(bǔ)體對照：將補(bǔ)體經(jīng) 56℃30 min 處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)　省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。