培養(yǎng)基研究促細(xì)胞分裂劑實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

　　通過(guò)促細(xì)胞培養(yǎng)基分裂劑與細(xì)胞表面受體相互作用，在體外觸發(fā)細(xì)胞的多克隆激活。根據(jù)所使用的促細(xì)胞分裂劑的不同，應(yīng)答細(xì)胞可以是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，或兩者同時(shí)，或者是單核細(xì)胞。細(xì)胞激活可以通過(guò)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、表面抗原表達(dá)和/或細(xì)胞體積的增加進(jìn)行檢測(cè)。例如在使用B細(xì)胞激活劑時(shí)，可以通過(guò)多克隆免疫球蛋白的分泌進(jìn)行檢測(cè)。

　　操作步驟：

　?。ㄒ唬┐偌?xì)胞分裂劑制備

　　根據(jù)說(shuō)明書將促細(xì)胞培養(yǎng)基分裂劑重新溶解于水或培養(yǎng)液中，制成儲(chǔ)存液（如100´），保存于-20℃。

　?。ǘ┐偌?xì)胞分裂劑滴定

　　1．在培養(yǎng)液中稀釋儲(chǔ)存液到所需的*個(gè)濃度，通常為理論*濃度的10倍；

　　2．在培養(yǎng)基板或試管中直接將促細(xì)胞分裂劑進(jìn)行濃度遞減系列稀釋（100 μl/孔）；

　　3．每孔平行重復(fù)三次；

　?。ㄈ┘?xì)胞激活

　　1．分離外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)基；

　　2．室溫下用培養(yǎng)液300´g離心10分鐘，收集并洗滌細(xì)胞；

　　3．計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞在培養(yǎng)液中重新懸浮至106細(xì)胞/ml，在培養(yǎng)板中每孔加入100μl；

　　4．在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（細(xì)胞增殖需2-3天；細(xì)胞因子測(cè)定測(cè)定6小時(shí)-2天；免疫球蛋白分泌測(cè)定需5-10天）；

　?。ㄋ模┘?xì)胞激活定量測(cè)定方法

　　1．培養(yǎng)基增殖檢測(cè)方法采用MTT測(cè)定法；

　　2．細(xì)胞因子分泌測(cè)定或使用市售商業(yè)化試劑盒；

　　3．免疫球蛋白分泌測(cè)定采用ELISA檢測(cè)