細(xì)胞培養(yǎng)基DNA覑段自主克隆復(fù)制研究

    DNA覑段的克隆需要合適的載體，載體或是質(zhì)粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經(jīng)過(guò)人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)必須能自主復(fù)制，即必須具備復(fù)制原點(diǎn)；二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn)，且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽(yáng)隆克隆，載體上常有篩選標(biāo)記，如對(duì)抗菌素的抗性，某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。

　　一、質(zhì)粒

　　常用的有pBR322，pUC系列質(zhì)粒等。

　　（一）pBR322質(zhì)粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體，有2個(gè)抗藥性基因（四環(huán)素和氨芐青霉素），一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)和多個(gè)用于克隆的限制酶切點(diǎn)。當(dāng)缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時(shí)，它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個(gè)抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點(diǎn)。一般只選一個(gè)抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽(yáng)性克隆之用。

　?。ǘ﹑UC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時(shí)，因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的α－肽補(bǔ)充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了α－肽的表達(dá)，因而在加入IPTG和X－gal的培養(yǎng)基，不能長(zhǎng)出藍(lán)色克隆，這就是所謂的藍(lán)白篩選。