PCR技術(shù)的定量原理:
擴(kuò)增曲線
在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。
在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。
PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。
熒光染料的優(yōu)點:
產(chǎn)品僅用于科研使用簡便;
可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合;
價格便宜;
熒光染料的缺點:
不能區(qū)分不同的雙鏈DNA
引物二聚體會影響檢測的敏感性
非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性
引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。
產(chǎn)品名稱 | |
英文名稱 | Mycobacterium kansasii |
貨號 | YSP96950 |
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熒光探針:
Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。
當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。
TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。
TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點:
熒光背景低;
敏感性高;
雜交穩(wěn)定性高;
熒光光譜分辨率好;
特異性高。
TaqMan探針技術(shù)的缺點:
成本高;
設(shè)計難度大;
只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。
由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。?
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
phospho-Caveolin-2(Tyr19) 英文名稱: 酸化細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-2抗體 0.1ml
Anti-BECN1 BECLIN-1抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
Phospho-ELk1(Ser383) 英文名稱: 酸化細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1抗體 0.1ml
X射線修復(fù)交叉互補蛋白/細(xì)胞堿基切除修復(fù)基因抗體 Anti-XRCC1 0.1ml
Anti-TSLPR/CRLF2/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗人、大、小鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素受體抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-IKK alpha/IKK beta (Ser180/Ser181) 酸化KB抑制蛋白激酶α/β抗體 規(guī)格 0.1ml
CASP4(Caspase-4) 半胱胺酸蛋白酶蛋白-4抗原Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
C10orf140 英文名稱: 10號染色體開放閱讀框140抗體 0.2ml
Anti-Phospho-PDGF Receptor beta (Tyr1021) 酸化血小板源性生長因子受體-B抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
Human Protein C ELISA Kit 人蛋白CMulti-class antibodies規(guī)格: 48T
Anti-PSMD9 蛋白酶調(diào)解因子9Multi-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rhesus antibody Rh HCG alpha(4A8) 人絨毛膜促性腺激素α 亞基單抗 規(guī)格 0.1ml
大鼠卵巢癌標(biāo)志物CA125ELISA Kit 大鼠卵巢癌標(biāo)志物CA125 96T
PRL 英文名稱: 泌乳素抗體 0.1ml
OF發(fā)酵管20支OF發(fā)酵管BR
ONPG發(fā)酵管20支ONPG發(fā)酵管BR
肝素抗凝管5毫升肝素抗凝管
10毫升
Rambach瓊脂250克Rambach瓊脂金黃色葡萄球菌快速顯色分離培養(yǎng)
耶爾森氏菌顯色培養(yǎng)基250克耶爾森氏菌顯色培養(yǎng)基耶爾森氏菌快速顯色分離培養(yǎng)
堪薩斯分枝桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒陽離子轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)樣蛋白2抗體PPIG/FITC 熒光素標(biāo)記親環(huán)蛋白(親環(huán)素)PPIG抗體IgG100 ul
15號染色體開放閱讀框62抗體PR/FITC 熒光素標(biāo)記孕激素受體抗體IgG100 ul
15號染色體開放閱讀框41抗體pRb/p105-Rb /FITC 熒光素標(biāo)記酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑癌蛋白抗體IgG100 ul
環(huán)核苷酸陽離子通道蛋白α2抗體PRCP/FITC 熒光素標(biāo)記脯氨酰羧肽酶抗體IgG100 ul
鈣連蛋白抗體Rb/RB1 proin/FITC 熒光素標(biāo)記視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul
二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2抗體Phospho-Rb (Ser608) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul
細(xì)胞色素P450ⅡE1抗體Phospho-Rb (Ser780)/FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG20 ul
趨化因子受體1抗體Phospho-Rb (Ser807/Ser811)/FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul
酸化原癌基因c-Raf抗體PRDX3/FITC 熒光素標(biāo)記過氧化還原酶3抗體IgG100 ul