蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中蘋果銹果類病毒（ASSVd）水平。用純化的蘋果銹果類病毒（ASSVd）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中蘋果銹果類病毒（ASSVd）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的蘋果銹果類病毒（ASSVd）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中蘋果銹果類病毒（ASSVd） 的存在與否。

樣本處理及要求：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

2. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

3. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

4. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟：

編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

溫育：操作同3。

洗滌：操作同5。

顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘

終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果判定：

  試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10

  臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為蘋果銹果類病毒（ASSVd）陰性

 蘋果銹果類病毒（ASSVd）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 陽(yáng)性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為蘋果銹果類病毒（ASSVd）陽(yáng)性